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Identifizierung von Bacillus-Stämmen durch MALDI-TOF-MS unter Verwendung eines geometrischen Ansatzes

Jul 14, 2023

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 16989 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Details zu den Metriken

Die Identifizierung von Mikroorganismen mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie basiert auf dem Vergleich des Massenspektrums des untersuchten Organismus mit denen von Referenzstämmen. Es handelt sich um eine schnelle und zuverlässige Methode. Kommerzielle Datenbanken und Programme dienen jedoch meist der Identifizierung klinisch wichtiger Stämme und können nur für bestimmte Massenspektrometermodelle verwendet werden. Der Bedarf an offenen Plattformen und Referenzdatenbanken liegt auf der Hand. In dieser Studie beschreiben wir einen geometrischen Ansatz zur Identifizierung von Mikroorganismen durch Massenspektren und demonstrieren seine Fähigkeiten durch die Analyse von 24 Stämmen der Bacillus pumilus-Gruppe. Diese Methode basiert auf der Darstellung von Massenspektren als Punkte in einem mehrdimensionalen Raum, wodurch wir geometrische Abstände zum Vergleich der Spektren verwenden können. Die durch einen geometrischen Ansatz durchgeführte Abgrenzung von Mikroorganismen korreliert gut mit den Ergebnissen der molekularen phylogenetischen Analyse und Clusterung mit Biotyper 3.1. Mit allen drei verwendeten Methoden konnten wir die Stämme zuverlässig in zwei Gruppen einteilen, die eng verwandten Arten, Bacillus pumilus und Bacillus altitudinis, entsprachen. Die von uns entwickelte Methode wird in einer Webschnittstelle implementiert, die für die Nutzung offener Referenzdatenbanken zur Identifizierung von Mikroorganismen konzipiert ist. Die Daten sind unter http://www.bionet.nsc.ru/mbl/database/database.html verfügbar.

Bei der Untersuchung von Bakterienstämmen, die aus extremen Umgebungen isoliert wurden, benötigen wir eine schnelle und zuverlässige Identifizierung von Bakterienstämmen, einschließlich solcher der Gattung Bacillus. Die Gattung Bacillus enthält grampositive aerobe oder fakultativ anaerobe stäbchenförmige Bakterien, die intrazelluläre Sporen bilden. Es umfasst über 80 gültige Arten1. Vertreter dieser Gattung kommen reichlich im Boden, in der Luft und im Wasser vor und werden häufig als Quelle industrieller Enzyme für die Lebensmittel-, Textil- und Chemieindustrie genutzt2. Sie werden auch als Expressionswirte für rekombinante Gene3 sowie als Quelle rekombinanter Gene4 verwendet. Bacillus-Stämme sind vielversprechend für die Landwirtschaft als pflanzenwachstumsfördernde Rhizobakterien5 und für den Einsatz in Dekontaminationssystemen6,7.

In den letzten 30 Jahren wurde die Systematik der Gattung grundlegend überarbeitet. Einige Arten wurden in neue Gattungen isoliert: Alicyclobacillus, Paenibacillus, Aneurinibacillus, Brevibacillus, Halobacillus, Virgibacillus, Filobacillus und Jeotgalibacillus. Auch die Gattung Bacillus enthält mehrere eng verwandte Artengruppen, deren Abgrenzung schwierig ist. Zur Bacillus cereus-Gruppe gehören beispielsweise Bacillus cereus, Bacillus anthracis und Bacillus thuringiensis, die genetisch sehr ähnlich sind, aber dennoch aufgrund unterschiedlicher Pathogenität als separate Arten gelten8. Ein weiteres Beispiel ist die Bacillus subtilis-Gruppe, die die Art Bacillus subtilis subsp. enthält. subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus atrophaeus, Bacillus mojavensis, Bacillus vallismortis, Bacillus subtilis subsp. spizizenii und Bacillus sonorensis. Die 16S-rRNA-Gensequenzen dieser Arten weisen eine Sequenzähnlichkeit von über 99 % auf, sodass sie allein anhand dieser nicht unterschieden werden können9. Basierend auf der Sequenz des gyrB-Gens10 wurde aus B. pumilus eine neue Art, Bacillus Safensis, isoliert und drei weitere Arten wurden mithilfe des polyphasischen Taxonomie-Ansatzes beschrieben: Bacillus altitudinis, Bacillus stratosphaericus und Bacillus aerophilus11. Diese Arten haben eng verwandte 16S-rRNA-Gensequenzen und bilden die B. pumilus-Gruppe12.

Klassische Methoden zur Identifizierung von Mikroorganismen, wie biochemische Tests und DNA-Sequenzierung, sind zeitaufwändig und arbeitsintensiv. Der neuere Ansatz, der die MALDI-TOF-Massenspektrometrie nutzt, ist einfach und schnell. Es basiert auf dem Vergleich des Proteinspektrums der untersuchten Probe mit einer Datenbank von Referenzspektren13. Mehrere Studien zeigten eine hohe Reproduzierbarkeit dieser Methode, sofern Standardprotokolle verwendet werden14,15,16,17. Es ist bekannt, dass die Identifizierungsgenauigkeit unterschiedliche Wachstumsbedingungen toleriert17,18,19.

Eine effektive Anwendung des Massenspektrometrie-Ansatzes erfordert eine umfassende Referenzdatenbank sowie spezielle Software zum Vergleich von Spektren. Derzeit sind mehrere kommerzielle Plattformen verfügbar: Biotyper (Bruker Daltonicks), Saramis (Shimadzu), Microbelynx (Waters Corporation) und Andromas. Diese Plattformen sind für bestimmte Modelle von Massenspektrometern konzipiert und recht teuer. Sie sind ebenfalls auf die klinische Diagnostik ausgerichtet und enthalten überwiegend pathogene Arten und Stämme. Aufgrund dieser Einschränkungen müssen Forschungsgruppen ihre eigenen „internen“ Datenbanken, mathematischen Algorithmen und Software entwerfen. Einige kommerzielle Produkte wie Statgraphics Plus 5.1 (Statpoint Technologies) und BioNumerics 6.0 (Applied-Maths) ermöglichen die Erstellung „interner“ Datenbanken, für eine effektive Entwicklung sind jedoch offene Plattformen einschließlich benutzergefüllter Datenbanken und Software für die Massenspektrenanalyse erforderlich des Feldes20.

Einer der ersten Versuche, eine solche Datenbank zu erstellen, war die BGP-Datenbank21 (http://bgp.sourceforge.net). Ein weiteres Beispiel ist die Spectra-Bank (http://www.spectrabank.org), eine Datenbank mit Massenlisten, die für Arten oder Stämme charakteristisch sind. Es enthält derzeit etwa 200 Exemplare. Charakteristische Massenlisten können mit SPECLUST22 verglichen werden, das eine Clusteranalyse durch die Erstellung eines Dendrogramms durchführt. Es können jedoch keine Datenbanksuchen durchgeführt werden und die relative Spitzenintensität wird nicht berücksichtigt.

Für Massenspektrometriedaten werden häufig geometrische Methoden verwendet, die Quelldaten als Punkte in einem mehrdimensionalen Raum darstellen. Sie werden hauptsächlich in der Clusteranalyse und der grafischen Darstellung der Aufteilung von Spektren in Gruppen mithilfe von Methoden wie PCA und MDS23,24 eingesetzt. Als Kriterien für den Vergleich unbekannter Spektren mit Datenbanken können metrische Abstände, beispielsweise euklidische Abstände, verwendet werden. Beispielsweise wurden die Abstände Hamming23 und Mahalanobis25 vorgeschlagen.

Da unser Hauptziel darin besteht, eine Plattform für eine offene Datenbank zur Identifizierung von Mikroorganismen zu entwickeln, müssen die mathematischen Algorithmen einfach und nicht rechenintensiv, aber gleichzeitig äußerst präzise sein. Wir haben den folgenden Algorithmus verwendet, der mit dem in ICiG SB RAS26 entwickelten JACOBI-4-Programm implementiert wurde: (1) Ein als (m/z; Intensität) dargestellter Datensatz wird auf einer (x; y)-Koordinatenebene übertragen, wobei xi diskret sind Mit einem bestimmten Intervall werden yi für jeden xi-Knoten gemäß der Peakkurvenformel berechnet, die es ermöglicht, das Spektrum als Vektor im mehrdimensionalen Raum darzustellen und einen Schwerpunkt für einen Vektorsatz für getestete Mikroorganismen zu berechnen. Diese Transformation ermöglicht die Anwendung aller geometrischen Methoden; (2) Für die erhaltenen Vektoren wird eine Matrix aus euklidischen Abständen und Jaccard-Koeffizienten (JC) berechnet, die Maße für die Unähnlichkeit/Ähnlichkeit der Spektren darstellen. Der Wert von 1 − JC ist eine Metrik27 und daher für unsere Ziele geeignet; (3) Zur Durchführung der Clusteranalyse und Datenvisualisierung wurden die Hauptkoordinatenmethode (PCo) und die Dendrogrammkonstruktion verwendet.

Ziel dieser Studie war es zu testen, ob der in dieser Studie vorgestellte Ansatz zur Identifizierung eng verwandter Arten verwendet werden kann. Als Beispiel haben wir eine Reihe von Stämmen der B. pumilus-Gruppe genommen, die eine Sequenzähnlichkeit von über 98 % für das 16S-rRNA-Gen aufwiesen. Für die 24 untersuchten Stämme haben wir Massenspektrenreihen erhalten und Schwerpunkte für die Clusteranalyse berechnet. Diese Daten wurden mit den Ergebnissen der 16S-rRNA-Gensequenzierung und der Analyse des MALDI Biotyper 3.1-Programms (Bruker Daltonics) verglichen. Die erhaltenen Schwerpunkte wurden als Referenzdatenbank zur Identifizierung von zwei Replikaten der untersuchten Stämme verwendet. Die Identifizierung basierte auf euklidischen Abständen und JC als Ähnlichkeitsmaß.

Da wir die Stämme mithilfe der GenBank-Datenbank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) anhand von 16S-rRNA-Gensequenzen nicht zuverlässig identifizieren konnten, verglichen wir sie mit Typstammsequenzen der Bacillus pumilus-Gruppe : B. pumilus (AY456263), B. altitudinis (AJ831842) und B. Safensis (AB681259) (Abb. 1a). B. stratosphaericus und B. aerophilus wurden von der Analyse ausgeschlossen, da ihre 16S-rRNA-Sequenzen mit denen von B. altitudinis identisch waren und diese Stämme in den mikrobiellen Stammkatalogen fehlten. Zwei Gruppen, die als A- und P-Gruppen bezeichnet werden, wurden in unserem Datensatz mit der Bootstrap-Unterstützung von 96 entdeckt. Die A-Gruppe umfasste auch Stämme, die aus Kamtschatka-Thermalquellen (KT) und der Rhizosphäre höherer Pflanzen aus der Oblast Nowosibirsk (RG) isoliert wurden als Stamm vom Typ B. altitudinis (AJ831842). Die P-Gruppe enthielt Stämme aus Salzseen der Oblast Nowosibirsk (NR), komplexen Erzlagerstätten der Oblast Kemerowo und Typstämme von B. pumilus (AY456263) und B. Safensis (AB681259). Innerhalb der Gruppen waren die Stämme eng miteinander verwandt, mit Ausnahme der Cd1- und KH2-Stämme, die mit der Bootstrap-Unterstützung von 73 einen einzelnen Subcluster innerhalb der A-Gruppe bildeten. Durch die Visualisierung der Sequenzen in BioEdit konnten wir sechs Markersubstitutionen finden (Abb. 1b). ), das diese Cluster auszeichnete. Andere Ersetzungen waren nicht aussagekräftig. Die Sequenzen der 16S-rRNA-Gene der aus Kamtschatka-Thermalquellen (KT) und aus der Rhizosphäre höherer Pflanzen aus der Oblast Nowosibirsk (RG) isolierten Stämme waren identisch mit B. altitudinis AJ831842, während die Sequenzen der Stämme aus Salzseen der Nowosibirsker Region identisch waren Oblast (NR) und komplexe Erzlagerstätten der Oblast Kemerowo (KR) unterschieden sich nicht von B. pumilus (AY456263). B. Safensis (AB681259) unterschied sich durch eine einzelne Nukleotidsubstitution von B. Pumilus (AY456263), was es uns ermöglichte, NR- und KR-Stämme als B. Pumilus zu identifizieren (Abb. 1b). Die KH2- und Cd1-Stämme wiesen identische Muster dieser sechs Markersubstitutionen auf wie der Stamm vom Typ B. altitudinis (AJ831842) und der Rest der A-Gruppe. Die Sequenz des B.-safensis-Typstamms (AB681259) unterschied sich von der von B. pumilus (AY456263) durch einen Markeraustausch. Auf dieser Grundlage identifizierten wir die Vertreter der A-Gruppe als B. altitudinis und der P-Gruppe als B. pumilus.

Phylogenetische Analyse.

(a) Phylogenetischer Baum, erstellt unter Verwendung des Maximum-Likelihood-Algorithmus für die 16S-rRNA-Gensequenzen. Die Zahlen über den Zweigen weisen auf Bootstrap-Unterstützung hin. Sequenzabstände geben die Anzahl der Substitutionen pro 1000 Nukleotide an. Zum Vergleich wurden die folgenden Typstammsequenzen verwendet: B. pumilus (AY456263), B. Safensis (AB681259) und B. Altitudinis (AJ831842); Als Außengruppe wurde B. licheniformis (EF433410) verwendet. (b) Fragmente des Alignments, die Markersubstitutionen enthalten. Die Zahlen in der unteren Zeile geben ihre Positionen in der B. altitudinis-Sequenz (AJ831842) an.

Massenspektren wurden wie im Abschnitt „Materialien und Methoden“ beschrieben erhalten und verarbeitet. Zur statistischen Signifikanz wurden für jeden Stamm 12 Proben entnommen und für jede Probe drei unabhängige Spektren aufgenommen. Die meisten der erhaltenen Spektren enthielten 50 bis 60 Massenpeaks im Bereich von 2–10 kDa. Die Matrix der euklidischen Abstände zwischen Schwerpunkten, die mithilfe der Hauptkoordinatenanalyse transformiert wurde, wurde als zwei zweidimensionale Diagramme in den Koordinaten PCo1, PCo2 und PCo1, PCo3 visualisiert (Abb. 2a, b). In beiden Projektionen unterscheiden sich die beiden Gruppen durch die Position auf der PCo1-Achse, die die größte Informationsmenge liefert. B. altitudinis-Stämme fielen in die A-Gruppe und B. pumulus-Stämme in die P-Gruppe. Der t-Test von Welsh wurde verwendet, um die Trennung der Dehnungsschwerpunkte in den Gruppen A oder P zu überprüfen (t = 11,16; p < 10−6; df = 22). Der Abstand zwischen den A- und P-Probenzentren entlang der PCo1-Achse betrug 2,4 und die Standardabweichungen für diese Proben betrugen 0,57 bzw. 0,39. Wir sollten auch beachten, dass die P-Gruppe im Vergleich zur A-Gruppe eine höhere Varianz entlang der PCo2-Achsen (PCo3) aufwies, was auf eine höhere Heterogenität hinweist. Die Clusteranalyse wurde durchgeführt, indem nach der Ward-Methode ein Dendrogramm unter Verwendung aller 23 Koordinaten erstellt wurde, die durch Transformation der Matrix der euklidischen Abstände erhalten wurden (Abb. 2c). Zum Vergleich ist ein mit Biotyper 3.1 erstelltes phyloproteomisches Dendrogramm dargestellt (Abb. 2d). Beide Dendrogramme zeigen zwei Cluster, die den A- und P-Gruppen im Diagramm (Abb. 2a, b) und dem 16S-rRNA-Genbaum (Abb. 1a) entsprechen.

Phyloproteomische Analyse.

Position der Spektralschwerpunkte auf der Hauptkoordinatenebene: (a) PCo1, PCo2; (b) PCo1, PCo3. Die Anteile der Gesamtvarianz für diese Achsen betrugen 29,2 % für PCo1, 13,2 % für PCo2 und 10,4 % für PCo3, was insgesamt 52,9 % ergibt. Die Gruppen A und P sind eingerahmt. Dendrogramme, die auf der Grundlage der Abstände zwischen Spektralschwerpunkten nach der Ward-Methode (c) und durch MSPs-Clustering in Biotyper 3.1 (d) erstellt wurden. Die Stämme wurden in zwei Cluster unterteilt, die B. altitudinis (A) und B. pumilus (P) entsprechen; (e) Nasslaborexperiment: Identifizierung der untersuchten Schwerpunkte für zwei biologische Replikate unter Verwendung von JC, euklidischen Distanzen und Biotyper 3.1 (Grenzkriterium – 2,0, was Bruker als „sichere Gattungsidentifizierung, wahrscheinliche Artenidentifizierung“ definiert). (e) Nasslaborexperiment: Identifizierung der untersuchten Schwerpunkte für zwei biologische Replikate unter Verwendung von JC, euklidischen Distanzen und Biotyper 3.1 (Grenzkriterium – 2,0, was Bruker als „sichere Gattungsidentifizierung, wahrscheinliche Artenidentifizierung“ definiert). Übereinstimmung auf Stammebene – Fall, bei dem der Schwerpunkt der getesteten Probe und der nächstgelegene Schwerpunkt in der Datenbank zu ein und demselben Stamm gehören.

Wir führten eine SPECLUST-Analyse durch, die eine Liste häufiger und gruppenspezifischer Peaks ergab. Bei allen untersuchten Stämmen wurden acht Peaks gefunden: 3048, 3621, 4914, 5208, 6622, 7242, 7729 und 9830 Da. Die A-Gruppe zeichnete sich durch das Vorhandensein des 6671 Da-Peaks aus, während die P-Gruppe drei charakteristische Peaks aufwies: 3765, 4589 und 6870 Da. In der Gelansicht visualisierte gemittelte Massenspektren zeigen, dass sich die A- und P-Gruppen durch das Vorhandensein gruppenspezifischer Peaks sowie durch ihre relativen Intensitäten unterscheiden (Abb. 3). Beispielsweise weisen die Peaks 4914, 6622, 7729 und 9830 Da höhere Intensitäten in der A-Gruppe auf. Mehrere hochintensive Peaks bei 6032, 6048, 6063, 6099 und 6117 Da zeigten keine Gruppenspezifität. B. altitudinis-Stämme hatten nur den 6099 Da-Peak, während ein B. pumilus-Stamm jeden dieser Peaks aufweisen kann. Dies ist wahrscheinlich die Ursache für die hohe Streuung entlang der PCo2- und PCo3-Achsen. Wir vermuten, dass diese Peaks ein einzelnes Protein darstellen, das in der B. pumilus-Gruppe stark polymorph ist.

Gelansicht gemittelter Massenspektren.

Gemeinsame Spitzenwerte sind durch Sternchen gekennzeichnet; für die A-Gruppe charakteristische Peaks nach (a); Peaks, die für die P-Gruppe charakteristisch sind, nach (p). Eingerahmt ist eine Gruppe hochintensiver Peaks im Bereich von 6032–6117 Da.

Die Kreuzvalidierung wurde mit zwei Methoden durchgeführt: durch Ausschluss eines von jeweils zehn zufälligen Sätzen von Spektrenproben und durch Ausschluss aller Spektren für eine zufällige Belastung. Bei der ersten Methode wurden die Spektren in 96,7 % der Fälle korrekt den Schwerpunkten zugeordnet. Die Genauigkeit der Gruppenbestimmung (A oder P) betrug 99,9 %.

Die erhaltenen Schwerpunkte wurden als Referenzdatenbank und Trainingsdatensatz zur Berechnung eines Cutoff-Kriteriums zur Identifizierung der untersuchten Stämme verwendet. Der Wert des JC-Cutoff-Kriteriums betrug 0,278 für die A-Gruppe und 0,158 für die P-Gruppe und für die euklidischen Abstände 3,35 bzw. 3,01. Zur Methodenüberprüfung führten wir zwei unabhängige Nasslaborexperimente durch. Abbildung 2e zeigt die Ergebnisse der Stammverifizierung mithilfe unserer Referenzdatenbank und Biotyper 3.1. Die Identifizierungsgenauigkeit betrug 100 % für euklidische Distanzen und 98 % für JC. Wir sollten beachten, dass das einzelne, nicht identifizierte Exemplar an der Grenze zur Identifizierungskorrektheit lag; Der Wert lag bei 0,277, während der Cutoff-Wert für diese Gruppe bei 0,278 lag. Übereinstimmungen auf Stammebene wurden ebenfalls berücksichtigt, wenn der Schwerpunkt der getesteten Probe und der nächstgelegene Schwerpunkt in der Datenbank für ein und denselben Stamm ermittelt wurden. Die Trefferquote lag bei JC und Biotyper bei 33,3 %. Für die euklidische Distanz betrug sie 20,8 %.

Die Proteinprofilierung mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie erwies sich als zuverlässig für die Identifizierung eng verwandter Arten, einschließlich Bacillus spp.28,29,30,31. Derzeit bestehen jedoch Einschränkungen durch das Fehlen freier Datenbanken und Software sowie durch die Tatsache, dass kommerzielle Datenbanken meist auf in der klinischen Praxis vorkommende Belastungen ausgerichtet sind. Neue Daten können diesen Datenbanken nur vom Hersteller hinzugefügt werden. Daher ist die Schaffung offener Plattformen und Datenbanken eine dringende Aufgabe.

Dieses Ziel erfordert eine einfache und zuverlässige Methode mit hoher Genauigkeit, die den Einsatz eines breiten Spektrums an Analysetechniken ermöglicht. In dieser Studie schlagen wir einen Algorithmus zur Darstellung von Massenspektren als Vektoren in einem mehrdimensionalen euklidischen Raum vor. Mit diesem Algorithmus können viele geometrische Methoden verwendet werden. Wir haben die euklidische Distanz als den einfachsten und unkompliziertesten Ansatz für den euklidischen Raum gewählt. Alternativ haben wir auch Jaccard-Koeffizienten implementiert, mit denen sich die Spektrenähnlichkeit berechnen lässt. Darüber hinaus ist 1 − JC ein geometrischer Abstand, der ihn für geometrische Methoden wie PCo geeignet macht.

Als Modell zum Testen dieses Ansatzes verwendeten wir 24 eng verwandte Stämme der B. pumilus-Gruppe aus der Sammlung des Instituts für Zytologie und Genetik SB RAS, die eine Sequenzähnlichkeit von über 98 % für das 16S-rRNA-Gen aufwiesen. Die untersuchten Stämme wurden aus verschiedenen extremen Lebensräumen in verschiedenen Regionen Russlands isoliert, darunter Thermalquellen, Salzseen, komplexe Erzlagerstätten usw. Für diese Arten fanden wir charakteristische Peaks in Massenspektren und charakteristische Nukleotidsubstitutionen im 16S-rRNA-Gen. 16S-rRNA-Sequenzen wurden verwendet, um die Ergebnisse der Massenspektrometrieanalyse zu validieren. Die Schwerpunkte der Massenspektren der untersuchten Stämme wurden in zwei Gruppen aufgeteilt, was durch den walisischen t-Test bestätigt wurde, auch wenn nur die erste Koordinate der PCo-Matrix (PCo1) verwendet wurde. Diese Gruppen entsprechen den beiden Clustern, die im Stammbaum entdeckt wurden. Ähnliche Ergebnisse liefert auch das mit der Ward-Methode unter Verwendung aller 23 Koordinaten erstellte Dendrogramm. Als zusätzliche Kontrolle führten wir eine zusätzliche Analyse der Massenspektrometriedaten mit Biotyper 3.0 durch. Mit allen drei verwendeten Methoden konnten wir zuverlässig zwischen zwei Gruppen unterscheiden, die zwei Arten entsprechen: B. pumilus (P) und B. altitudinus (A).

Die erhaltene Referenzdatenbank wurde zur Identifizierung der untersuchten Mikroorganismen durch Nasslaborexperimente verwendet. Die Identifizierungsgenauigkeit betrug 98 % für JC und 100 % für euklidische Abstände. Die Biotyper 3.1-Analyse ergab eine Identifizierungsgenauigkeit von 100 %, wenn 2,0 als Cutoff-Score verwendet wurde, was von Bruker als „sichere Gattungsidentifizierung, wahrscheinliche Artenidentifizierung“ definiert wird. Der Wert des nicht identifizierten KG16(3)-Stamms für die JC-Analyse lag an der Grenze des Cutoff-Werts für die A-Gruppe. In dieser Studie hatten wir für jede Art separate Grenzwerte, da die Schwerpunkte der A-Gruppe im geometrischen Raum 1 − JC deutlich kompakter waren als die Schwerpunkte der P-Gruppe (Daten nicht gezeigt). Daher war der Cutoff-Score für die A-Gruppe strenger (0,278) als für die P-Gruppe (0,158). Wenn die Cutoff-Werte für die beiden Gruppen gemittelt wurden, hatte der JC-Algorithmus eine Identifizierungsgenauigkeit von 100 %. Auch eine höhere Übereinstimmungsrate auf Dehnungsebene für JC als für die euklidische Distanz bietet möglicherweise eine bessere Leistung dieser Methode zur Identifizierung der Dehnungsebene.

Daher haben wir gezeigt, dass der in dieser Studie vorgeschlagene Ansatz zur Identifizierung eng verwandter Arten auf der Grundlage ihrer Massenspektren geeignet ist, wobei B. pumilus und B. altitudinis als Modell dienen. Die theoretische Darstellung von Massenspektren als Vektoren im euklidischen Raum ermöglicht die Verwendung einer praktisch unbegrenzten Anzahl von Koordinaten für jeden Schwerpunkt, wodurch wir sowohl Peaklisten als auch Rohmassenspektren, die das Spektrum als Kurve beschreiben, als Quelldaten verwenden können. Dadurch können wir die Peakform berücksichtigen und auf den Peak-Peaking-Algorithmus verzichten. Die Schwerpunkte, euklidischen Abstände und Stammbeschreibungen sind im Internet verfügbar: http://www.bionet.nsc.ru/mbl/database/database.html.

Aus der Sammlung extremophiler Mikroorganismen von ICiG SB RAS haben wir 24 Stämme ausgewählt, die aufgrund ihrer morphologischen und biochemischen Merkmale als zur B. pumilus-Gruppe gehörend identifiziert wurden. Diese Gruppe umfasste Stämme, die aus extremen Umgebungen verschiedener Regionen Russlands isoliert wurden, darunter Thermalquellen, Salzseen, komplexe Erzlagerstätten usw. (Tabelle 1).

Ein Fragment des ribosomalen 16S-rRNA-Gens wurde unter Verwendung der universellen Bakterienprimer 16S-8-fB (5′-AGRGTTTGATCCT GGCTCA-3′) und 16S-1350-rB (5′-GACGGGCGGTGTGTACAAG-3′) in einem Volumen von 30 Mikrolitern amplifiziert ein MyCycler-Thermocycler (BioRad) unter Verwendung von TaqSE-DNA-Polymerase (SibEnzyme, Novosibirsk) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Amplifizierte Produkte wurden mit dem PCR-Reinigungs-KIT (Fermentas) gereinigt. Die DNA-Sequenzierung wurde mit dem BigDye Terminator 3.1-Kit (Applied Biosystems) gemäß den Anweisungen des Herstellers in der SB RAS Genomics Core Facility durchgeführt. Sequenzen wurden mit dem Programm BioEdit (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit) analysiert und bearbeitet. Die folgenden Typstammsequenzen wurden für die phylogenetische Analyse verwendet: B. pumilus (AY456263), B. altitudinis (AJ831842) und B. Safensis (AB681259); Als Außengruppe wurde B. licheniformis (EF433410) verwendet. Die Sequenzen wurden von ClustalW232 abgeglichen und phylogenetische Bäume mithilfe des in MEGA 6.034 implementierten Maximum-Likelihood-Algorithmus33 erstellt. Alle von uns erhaltenen 16S-rRNA-Sequenzen wurden in der GenBank hinterlegt (Tabelle 1).

Für jeden Stamm wurden zwölf separate Kolonien entnommen. Die Kolonien wurden mit einer mikrobiellen Transferschleife in ein 1,5-ml-Eppendorf-Röhrchen übertragen und in 300 Mikroliter entionisiertem Wasser resuspendiert. Zur Inaktivierung von Bakterienzellen wurden 900 Mikroliter Ethanol hinzugefügt; Die Zellen wurden resuspendiert und durch 2-minütige Zentrifugation bei 15600 g sedimentiert. Der Überstand wurde entfernt und das Sediment 5 Minuten lang in einem Eppendorf-Vakuumkonzentrator getrocknet. Bakterienzellwände wurden durch die Zugabe von 50 Mikroliter 70 %iger Ameisensäure zerstört. Die Proteine ​​wurden durch Zugabe von 50 Mikroliter Acetonitril und anschließendes kräftiges Vortexen extrahiert. Die Mischung wurde 2 Minuten lang bei 15600 g zentrifugiert und der Überstand zur massenspektrometrischen Analyse in ein sauberes Röhrchen überführt.

Für die massenspektrometrische Analyse wurde 1 Mikroliter Proteinextrakt auf eine Edelstahlplatte übertragen und bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Anschließend wurde 1 Mikroliter Matrix (6 mg/ml α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure in Acetonitril/Wasser/Trifluoressigsäure-Lösung (50:47,5:2,5, v/v)) zugegeben. Die Spektren wurden mit einem Ultraflex III MALDI TOF/TOF-Massenspektrometer (Bruker Daltonics) im linear positiven Modus mit einer Laserfrequenz von 100 Hz im Massenbereich von 2000–20000 Da erhalten. Die Spannung an der Beschleunigungselektrode betrug 25 kV; IS2-Spannung, 23,45 kV; Linsenspannung, 6 kV; Es wurde keine Extraktionsverzögerung vorgenommen.

Für jede Kolonie erhielten wir drei Spektren durch Summieren von 500 Laserpulsen (5 × 100 Pulse von verschiedenen Positionen der Zielzelle). Die Kalibrierung wurde mit Escherichia coli-Proteinen durchgeführt: RL36 – 4365,3 Da, RS22 – 5096,8 Da, RL34 – 5381,4 Da, RL32 – 6315,0 Da, RL29 – 7274,5 Da, RS19 – 10300,1 Da.

Für jeden Stamm wurden insgesamt 36 Spektren aufgenommen. Zusätzlich zur Computeranalyse wurde für alle Spektren eine visuelle Inspektion durchgeführt.

Abflachung, Basislinienextraktion und Peakpicking für die erhaltenen Massenspektren wurden mit mMass35 (www.mmass.org) durchgeführt.

In mMass erhaltene Massenlisten wurden mit dem folgenden Algorithmus verarbeitet:

Eine Reihe von Spektren wird dargestellt als {(xj, yj), j = 1…Lm; m = 1…M}, wobei xj die Peakanzahl ist, yj die Funktion der Signalintensität ist, Lm die Anzahl der Peaks für jedes Spektrum ist, M die Anzahl der Spektren ist. Spektren werden in Q-Klassen eingeteilt.

Jedes Spektrum wird auf ein in der x-Koordinate einheitliches Gitter projiziert. Für jedes Spektrum hat das Gitter die gleichen Grenzen (Xbeg, Xend), die gleiche Anzahl von Punkten N und die gleiche Fensterhalbbreite K, gemessen in Punkten. Die Parameter Xbeg, Xend, N und K werden vom Benutzer eingestellt. Der Rasterabstand h und die Halbwertsbreite w werden anhand der Eingabeparameter berechnet:

Für jedes Spektrum muss folgende Bedingung erfüllt sein: Xbeg < Xmin − w; Xend > Xmax + w, wobei Xmin und Xmax die minimalen und maximalen Werte für die x-Koordinate für jedes Spektrum sind.

Für jeden Netzpunkt i finden wir alle x-Koordinaten xj im Bereich [ih − w, ih + w] mit yj-Signalintensitäten ungleich Null. Für jedes eingerahmte Signal wird seine Auswirkung auf den Punkt i nach folgender Formel berechnet:

wobei f(x) = 1 − 3x2 + 2|x|3 wenn |x| ≤ 1 und f(x) = 0 sonst.

Der zusammengefasste Einfluss zi auf Punkt i wird nach folgender Formel berechnet:

für jedes xj innerhalb des Fensters [ih − w, ih + w], wobei S die Kombinationsmethode (Summe, Mittelung, Maximum) ist. Als Ergebnis dieses Algorithmus wurde für jedes Spektrum ein Vektor der Größe N erhalten.

In dieser Arbeit haben wir die folgenden Parameter verwendet: Xbeg = 1000; Xend = 15000; N = 14000; K = 5; Kombinationsmethode war die Mittelwertbildung.

Als Spektren auf das Gitter projiziert wurden, wurden Schwerpunkte für jede der Q-Klassen berechnet. Eine Matrix euklidischer Abstände zwischen allen Schwerpunkten wurde berechnet und durch die Hauptkoordinatenanalyse (PCo) verarbeitet, die es uns ermöglichte, alle Klassenschwerpunkte als Punkte in einem mehrdimensionalen euklidischen Raum mit einer Dimension von nicht mehr als Q − 1 darzustellen. Welshs t-Kriterium war Wird zur Validierung der untersuchten Gruppen im PCo-Diagramm verwendet. Dendrogramme wurden mit der Ward-Methode vom PAST-Programm36 erstellt.

Jaccard-Koeffizienten werden nach der Formel37 berechnet:

wobei x = {xi : xi ≥ 0}, y = {yi : yi ≥ 0} Vektordarstellungen von Spektren sind.

Spitzenfrequenzen wurden mit SPECLUST mit dem „Peak-in-Common“-Verfahren analysiert. Die Suche wurde im Bereich von 2 bis 10 kDa durchgeführt, was mit dem Parameterwert „Breite im Peak-Match-Score“ von 5 Da eine optimale Peak-Reproduzierbarkeit bietet. Zusätzlich wurden die Spektren visuell analysiert.

Darüber hinaus wurden in Biotyper 3.1 „Hauptspektren“ (MSPs) für die erhaltenen Massenspektren generiert und ein phyloproteomisches Diagramm unter Verwendung von Standardparametern erstellt18.

Für Nasslaborexperimente wurden alle untersuchten Stämme unter den gleichen Bedingungen wie die Trainingsprobe gezüchtet (Tabelle 1). Für die Massenspektrometrie haben wir für jede Probe drei Replikate erstellt, jeweils ein Spektrum pro Replikat. Die Probenschwerpunkte wurden wie im Abschnitt „Phyloproteomische Analyse von Massenspektrometriedaten“ beschrieben berechnet.

Ziel der Experimente war es, jedes getestete Exemplar entweder der A- oder P-Gruppe oder einer separaten Art zuzuordnen. Der Abschneideradius der Gruppe i (A oder P) wurde mit der folgenden Formel38 berechnet:

wobei Xi die Menge von i Schwerpunkten ist; d(x, y) ist der Abstand zwischen den Spektren x und y.

Ein Schwerpunkt der untersuchten Probe gehört zur „Anziehungszone“ der Gruppe i, wenn sein Abstand von mindestens einem Schwerpunkt dieser Gruppe Radi nicht überschreitet. Wenn die Probe zu einer oder mehreren „Anziehungszonen“ verschiedener Gruppen gehört, wird sie der Gruppe mit dem nächstgelegenen Schwerpunkt zugeordnet. Wenn ein Exemplar nicht zur „Anziehungszone“ einer Gruppe in der Datenbank gehört, wird es als unbekannte Art behandelt.

Zitierweise für diesen Artikel: Starostin, KV et al. Identifizierung von Bacillus-Stämmen durch MALDI-TOF-MS unter Verwendung eines geometrischen Ansatzes. Wissenschaft. Rep. 5, 16989; doi: 10.1038/srep16989 (2015).

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Die Arbeit von KVS, EAD, AVB, ASR und SEP wurde durch das Budgetprojekt VI.58.1.3 unterstützt. Die Arbeit von VME wurde von der Russischen Wissenschaftsstiftung unterstützt (Projekt Nr. 14-24-00123). Die Autoren möchten den Mitarbeitern des Kronotsky State Biosphere Reserve für die Unterstützung bei der Arbeit in der Uzon-Caldera danken.

Institut für Zytologie und Genetik, Sibirische Abteilung der Russischen Akademie der Wissenschaften, Nowosibirsk, 630090, Russische Föderation

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KVS und EAD führten MS-Experimente und Datenanalysen durch. AVB führte die Isolierung und Kultivierung mikrobieller Kulturen durch. Der mathematische Algorithmus wurde von VMEASR entwickelt und führte eine 16-s-rRNA-Sequenzierung durch. SEP betreute dieses Projekt. Alle Autoren waren an der Erstellung des Manuskripts beteiligt.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Starostin, K., Demidov, E., Bryanskaya, A. et al. Identifizierung von Bacillus-Stämmen durch MALDI-TOF-MS unter Verwendung eines geometrischen Ansatzes. Sci Rep 5, 16989 (2015). https://doi.org/10.1038/srep16989

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Eingegangen: 27. März 2015

Angenommen: 22. Oktober 2015

Veröffentlicht: 23. November 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep16989

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